چکیده 

دسفری اکسامینB،‌ تنها سیدروفوری است که فرم مزتیله آن (نمک متان سولفونات دسفری اکسامین B) با نام تجاری دسفرال جهت درمان بیماران تالاسمی، به منظور شلاته کردن بار اضافی آهن، استفاده می گردد.

به همین منظور جهت تولید دسفری اکسامین B، از سویه استرپتومایسس پیلوسوس استفاده گردید و سویه مربوطه در محیط کشت Soy bean کشت داده شد و دسفری اکسامین آن بوسیله استفاده از محلول فنل- کلروفرم و اتر استخراج گردید. به منظور طراحی این سیستم بیولوژیکی و افزایش بهره برداری از محصول مذکور از منابع کربن و نیتروژن مختلف استفاده گردید و تاثیر هر یک بر میزان دسفری اکسامین تولیدی بررسی شد. چنانچه مشاهده گردید که اسید آمینه ترئونین، افزایش قابل ملاحظه ای بر دسفری اکسامین تولیدی از سویه مذکور دارد و مقدار %۱۲۵/۰ ترئونین، در محیط کشت Soy bean، بسیار مطلوب می باشد. از طرفی اثر ویتامین تیامین (B₁)بررسی گردید و مشاهده شد که تاثیر مثبت بر دسفر اکسامین تولیدی دارد و در رده بعد از اسید آمینه ترئونین قرار می گیرد. همچنین اثر اسید آمینه لوسین نیز بر تولید دسفری اکسامین مثبت بوده و در رده بعد از ویتامین تیامین (B₁) قرار می گیرد.

در ایـن تحقـیق از شلاته کننـده های کاتیونی EDTA، ۸-hydroxyquinoline  در محـیط کشت Soy bean استفاده شد و مشاهده گردید که شلاته کننده های مذکور اثر منفی بر تولید دسفری اکسامین  دارند در نتیجه، کاتیونها، اثر مثبت بر افزایش میزان دسفری اکسامین تولیدی خواهند داشت به همین منظور مواد معدنی مختلف از جمله اثر

CaCl₂.2H₂O,MgSO₄.7H₂O,ZnSO₄.7H₂O, MnCl₂, FeSO₄.7H₂O

و همچنین  اثرCaCl₂.2H₂O,MgSO₄.7H₂O به طور همزمان در محیط کشت Soy bean بررسی گردید.

در این تحقیق نتایج مطلوبی بدست آمد، بطوری که کلسیم (بصورت CaCl₂.2H₂O) اثر قابل ملاحظه‌ای بر افزایش میزان دسفری اکسامین تولیدی از سویه مذکور دارد و مقدار ۸/۲، و ۲، CaCl₂.2H₂O سبب افزایش قابل توجهی بر میزان محصول مذکور می گردد. و بدین ترتیب تاثیر مثبت کلسیم، بر تولید دسفری اکسامین مشخص گردید.

در این آزمایشات تاثیر مثبت روی، منیزیم و منگنز بر دسفری اکسامین تولیدی آشکار گردید بطوری که غلظت  ^۲-۱۰ × ۴/۰، ZnSO₄.7H₂O و  ۶/۰، MgSO₄.7H₂O و  ۲، MnCl₂ سبب افزایش تولید دسفری اکسامین شد.

فهرست مطالب

چکیده…………………………………………………………………………………………………………………………. ۱

مقدمه………………………………………………………………………………………………………………………….. ۳

فصل اول

۱-۱ – تالاسمی……………………………………………………………………………………………………………… ۸

۱-۲-اتیولوژی و سبب شناسی تالاسمی……………………………………………………………………………….. ۸

۱-۲-۱ – خون شناسی…………………………………………………………………………………………………….. ۹

۱-۲-۲- خون سازی و گلبولهای قرمز……………………………………………………………………………….. ۱۰

۱-۳- تالاسمی و انواع آن………………………………………………………………………………………………. ۱۰

۱-۳-۱ آلفا تالاسمی……………………………………………………………………………………………………… ۱۰

۱-۳-۲- بتا تالاسمی……………………………………………………………………………………………………… ۱۱

۱-۳-۲-۱ بتا تالاسمی مینور(سالم ناقل)……………………………………………………………………………… ۱۱

۱-۳-۲-۲ – بتا تالاسمی ماژور( بیماری تالاسمی)………………………………………………………………… ۱۲

۱-۳-۲-۳-بتا تالاسمی بینابینی…………………………………………………………………………………………. ۱۳

۱-۴- تشخیص تالاسمی………………………………………………………………………………………………… ۱۳

۱-۵- درمان تالاسمی…………………………………………………………………………………………………….. ۱۳

۱-۶- فیزیولوژی عنصر آهن و اهمیت آن در بدن انسان…………………………………………………………. ۱۴

۱-۶-۱- مسمومیت حاد آهنی………………………………………………………………………………………….. ۱۵

۱-۷- دسفرال……………………………………………………………………………………………………………… ۱۶

۱-۷-۱- نحوه استفاده از داروی دسفرال…………………………………………………………………………….. ۱۷

۱-۷-۲-کاربردهای داروی دسفرال در پزشکی…………………………………………………………………….. ۱۸

۱-۷-۳- عوارض ناشی از داروی دسفرال…………………………………………………………………………… ۱۹

۱-۷-۴- اقدامات احتیاطی در مورد داروی دسفرال……………………………………………………………….. ۱۹

۱-۷-۵- ملاک توقف درمان بوسیله دسفرال………………………………………………………………………… ۲۰

فصل دوم

۲-۱-  سیدرو فورها……………………………………………………………………………………………………… ۲۲

۲-۱-۱- هیدروکسامات ها……………………………………………………………………………………………… ۲۴

۲-۱-۲-فنولات ها یا کاتکولات ها……………………………………………………………………………………. ۲۵

۲-۲- دسفری اکسامین ها………………………………………………………………………………………………. ۲۶

۲- ۲-۱ – ساختمان دسفری اکسامین………………………………………………………………………………… ۲۸

۲-۲-۲- دسفراکسامین بصورت آنتی اکسیدان……………………………………………………………………… ۲۸

۲-۲-۳ – خصوصیات فیزیکو و شیمیایی دسفراکسامین…………………………………………………………. ۲۹

۲-۲-۴- مکانیسم دسفراکسامین در جلوگیری از بیماریهای با بار اضافی آهن………………………………. ۲۹

۲-۲-۵- تشکیل رادیکال  DFO nitroxide…………………………………………………………………….. 30

2-3-  دسفری اکسامین B……………………………………………………………………………………………… 31

2-3-1- بیوسنتر دسفری اکسامین B…………………………………………………………………………………. 33

2-3-2- ژنهای کد کننده دسفری اکسامین B………………………………………………………………………. 33

2-4- تولید کننده­های دسفری اکسامین………………………………………………………………………………. ۳۴

۲-۵- اهمیت آهن بر روی میکروارگانیسمها……………………………………………………………………….. ۳۵

۲-۶- مکانیسم عمل سیدروفورها در ارتباط با انتقال آهن به درون سلول میکروارگانیسمها………………. ۳۶

۲-۷- تولید، استخراج و تخلیص دسفری اکسامین B…………………………………………………………….. 37

فصل سوم

۳-۱- اکتینومیست ها…………………………………………………………………………………………………….. ۴۰

۳-۲- استرپتومایسس ها…………………………………………………………………………………………………. ۴۳

۳-۲-۱- پاتولوژی………………………………………………………………………………………………………… ۴۳

۳-۲-۲ – مرفولوژی و ساختمان………………………………………………………………………………………. ۴۳

۳-۲-۳- مشخصات کلنی……………………………………………………………………………………………… ۴۵۴

۳-۲-۴- اسپورزایی……………………………………………………………………………………………………….. ۴۷

۳-۲-۵- ترکیبات پوشش سلولی………………………………………………………………………………………. ۴۹

۳-۲-۶- تغذیه و فاکتورهای موثر بر رشد و خصوصیات فیزیکوشیمیایی…………………………………….. ۴۹

۳-۲-۶-۱- تغذیه…………………………………………………………………………………………………………. ۴۹

۳-۲-۶-۲- اکسیژن……………………………………………………………………………………………………….. ۵۰

3-2-6-3 – رطوبت……………………………………………………………………………………………………… ۵۰

۳-۲-۶-۴- دما…………………………………………………………………………………………………………….. ۵۱

۳-۲-۶-۵- pH…………………………………………………………………………………………………………… 51

3-2-6-6- اکولوژی……………………………………………………………………………………………………… ۵۲

۳-۲-۶-۷- بیولوژی توسعه یافته استرپتومایسس…………………………………………………………………… ۵۳

۳-۲-۷- انواع فرآورده های میکروبی………………………………………………………………………………… ۵۶

۳-۲-۷-۱- متابولیت های اولیه………………………………………………………………………………………… ۵۶

۳-۲-۷-۲- متابولیت های ثانویه……………………………………………………………………………………….. ۵۶

۳-۲-۷-۲-۱- آنتی بیوتیک ها…………………………………………………………………………………………. ۵۸

۳-۲-۷-۲-۱-۱- فیزیولوژی و تنظیم تولید آنتی بیوتیک…………………………………………………………. ۵۸

۳-۲-۷-۳- آنزیمها……………………………………………………………………………………………………….. ۶۳

۳-۲-۷-۳-۱- پروتئازها…………………………………………………………………………………………………. ۶۳

۳-۲-۷-۳-۱-۱- پروتئازهای اسیدی…………………………………………………………………………………. ۶۷

۳-۲-۷-۳-۱-۱-۱- رنین……………………………………………………………………………………………….. ۶۷

۳-۲-۷-۳-۱-۲- پروتئازهای خنثی…………………………………………………………………………………… ۶۷

۳-۲-۷-۳-۱-۳- پروتئاز های قلیایی…………………………………………………………………………………. ۶۷

۳-۲-۷-۳-۱-۳-۱- فرآیند تخمیر پروتئازهای قلیایی…………………………………………………………….. ۶۸

۳-۲-۷-۳-۱-۳-۲- تعیین فعالیت پروتئاز قلیایی………………………………………………………………….. ۶۹

۳-۲-۷-۳-۱-۴- بازدارنده های فعالیت آنزیم پروتئاز وشلاته کننده ها……………………………………….. ۶۹

۳-۲-۷-۳-۱-۵- تجزیه…………………………………………………………………………………………………. ۷۱

۳-۲-۷-۳-۱-۶- پروتئاز ها و استرپتومایسسها…………………………………………………………………….. ۷۱

۳-۲-۸- محیط کشت  تخمیر صنعتی………………………………………………………………………………… ۷۱

۳-۲-۸-۱- نیازهای غذایی میکروارگانیسم‌ها……………………………………………………………………….. ۷۱

۳-۲-۸-۱-۱- کربن………………………………………………………………………………………………………. ۷۴

۳-۲-۸-۱-۱-۱- منابع کربن و استرپتومایسس ها…………………………………………………………………. ۷۷

۳-۲-۸-۱-۲-نیتروژن……………………………………………………………………………………………………. ۷۸

۳-۲-۸-۱-۲-۱-  منابع نیتروژن و استرپتومایسس ها…………………………………………………………….. ۸۰

۳-۲-۸-۱-۳- هیدروژن و اکسیژن……………………………………………………………………………………. ۸۰

3-2-8-1-4- مواد معدنی………………………………………………………………………………………………. ۸۰

۳-۲-۸-۲-تنظیم کننده های متابولیکی………………………………………………………………………………… ۸۱

۳-۲-۸-۳- ضد کف ها…………………………………………………………………………………………………. ۸۲

۳-۲-۹- بیوسنتز  در استرپتومایسس ها………………………………………………………………………………. ۸۳

فصل چهارم

۴-۱- دستگاه های مورد استفاده……………………………………………………………………………………….. ۸۶

۴-۲- وسایل مورد استفاده………………………………………………………………………………………………. ۸۶

۴-۳ – محیط های کشت مایع برای رشد باکتری………………………………………………………………….. ۸۸

۴-۴- محیط های کشت جامد برای رشد باکتری………………………………………………………………….. ۸۹

۴-۵- محیط های جامد برای تولید اسپور……………………………………………………………………………. ۸۹

۴-۶- مواد لازم جهت رنگ آمیزی گرم……………………………………………………………………………… ۹۰

۴-۷- مواد لازم جهت استفاده از میکروسکوپ نوری…………………………………………………………….. ۹۱

۴-۸- محیط مورد استفاده جهت شناسایی کیفی دسفری اکسامین: محیط Des₄……………………………. 91

4-9- محیط مورد استفاده جهت اندازه گیری تولید دسفری اکسامین محیط Soy bean ………………. 91

4-10- مواد لازم جهت نگهداری و ذخیره باکتری ها…………………………………………………………….. ۹۲

۴-۱۱- معرف های دسفری اکسامین…………………………………………………………………………………. ۹۲

۴-۱۲- مواد لازم جهت رسم منحنی استاندارد دسفری اکسامین B……………………………………………. 92

4-13- مواد لازم جهت استخراج دسفری اکسامین………………………………………………………………… ۹۲

۴-۱۴- مواد لازم جهت تهیه محلول Lysing Buffer…………………………………………………………. 93

4-14-1 – مواد لازم جهت تهیه محلول Tris Hcl……………………………………………………………… 93

4-15- محلول کازئین %۵/۰ دربافر فسفات…………………………………………………………………………. ۹۳

۴-۱۵-۱- بافر فسفات (PBS)……………………………………………………………………………………….. 93

4-16- محلول لوری (Lowry)……………………………………………………………………………………… 93

فصل پنجم

۵ – ١- تهیه و آماده سازی سویه استرپتومایسس پیلوسوس…………………………………………………….. ۹۸

۵ ـ ٢ ـ بررسی خصوصیات مرفولوژیکی سویه استرپتومایسس پیلوسوس……………………………………. ۹۸

۵-٢-١- خصوصیات ماکروسکوپی…………………………………………………………………………………… ۹۹

۵- ٢-١-١- کشت استرپتومایسس پیلوسوس بر روی محیط جامد……………………………………………. ۹۹

5-٢-١-٢- کشت استرپتومایسس پیلوسوس در محیط مایع…………………………………………………….. ۹۹

۵-٢-٢ خصوصیات میکروسکوپی…………………………………………………………………………………….. ۹۹

۵-٢-٢-١- تهیه لام از محیط کشت جامد…………………………………………………………………………… ۹۹

۵-٢-٢-٢- تهیه لام از محیط کشت مایع………………………………………………………………………….. ۱۰۰

۵ـ ٢ـ٢ـ ٣ـ رنگ آمیزی گرم…………………………………………………………………………………………. ۱۰۰

۵ ـ ٣ـ تهیه مایع تلقیح…………………………………………………………………………………………………. ۱۰۰

۵ ـ ٣ـ ١ـ تهیه محیط ذخیره………………………………………………………………………………………….. ۱۰۱

۵ ـ ٣ـ ٢ـ تهیه سوسپانسیون اسپور………………………………………………………………………………….. ۱۰۱

۵ـ ۴ـ رسم منحنی رشد استرپتومایسس پیلوسوس……………………………………………………………….. ۱۰۱

۵ـ ۵ـ بررسی تغییرات  pH در محیط کشت Soybean…………………………………………………….. 102

5ـ ۶ـ تولید دسفری اکسامین توسط استرپتومایسس پیلوسوس……………………………………………….. ۱۰۲

۵ـ ۶ـ ١ـ تشخیص کیفی دسفری اکسامین………………………………………………………………………… ۱۰۲

۵ـ ۶ـ ٢ـ سنجش میزان تولید دسفری اکسامین در هر روز…………………………………………………….. ۱۰۳

۵-۶-۳- رسم منحنی استاندارد دسفرال…………………………………………………………………………….. ۱۰۳

۵-٧ـ استخراج دسفری اکسامین بوسیله فنل-کلروفرم………………………………………………………….. ۱۰۴

 ۵ ـ ٧ـ ١ـ مزتیله کردن دسفری اکسامین………………………………………………………………………….. ۱۰۵

۵-۸- تعیین وجود دسفری اکسامین B در ماده استخراج شده………………………………………………… ۱۰۵

۵ـ ٩ـ  بهینه سازی محیط کشت تولید دسفری اکسامین………………………………………………………… ۱۰۷

۵ـ ٩ـ ١ـ بررسی اثر اسید آمینه ترئونین بر تولید دسفری اکسامین……………………………………………. ۱۰۷

۵ ـ ٩ـ ١ـ ١ـ بررسی اثر اسید آمینه ترئونین بر تولید دسفری اکسامین در یک محدوده غلظت………… ۱۰۷

۵ـ ٩ـ ٢ـ بررسی اثر اسیدآمینه ترئونین و اسید آمینه لوسین و ویتامین تیامینB₁)  ( برتولید دسفری اکسامین ۱۰۸

۵ ـ ٩ـ ٣ـ بررسی گلوکز و ملاس و سوکروز بر تولید دسفری اکسامین……………………………………. ۱۰۸

۵ـ ٩ـ ۴ـ بررسی اثر شلاته کننده های کاتیون بر تولید دسفری اکسامین…………………………………….. ۱۰۸

۵ ـ ٩ـ ۵ـ  استفاده از محیط کشت عصاره مخمر به جای استفاده از محیط کشت Soybean……….. 109

5 ـ ٩ـ ۶ـ بررسی اثر مواد معدنی مختلف بر میزان تولید دسفری اکسامین…………………………………. ۱۰۹

۵ ـ٩ـ۶ـ١ـ بررسی تاثیر مواد معدنی در غلظت های مختلف بر میزان تولید دسفری اکسامین………….. ۱۱۱

5 ـ ١٠ – بررسی پروتئاز تولیدی از استرپتومایسس پیلوسوس در حضور شلاته  کننده ها و مواد معدنی مختلف        ۱۱۲

۵ ـ ١٠ـ ١ـ کشت باکتری و سنجش پروتئاز……………………………………………………………………… ۱۱۲

۵ ـ ١٠ـ ۲ـ تخلیص کازئین…………………………………………………………………………………………… ۱۱۳

فصل ششم

۶ـ ١ـ بررسی خصوصیات مرفولوژیکی ماکروسکوپی استرپتومایسس پیلوسوس………………………….. ۱۱۵

۶ـ ١ـ ١­ـ خصوصیات ماکروسکوپی سویه استاندارد بر روی محیط کشت جامد………………………….. ۱۱۵

۶ ـ ١ـ٢ـ خصوصیات ماکروسکوپی سویه استاندارد در محیط کشت مایع…………………………………. ۱۱۵

۶ ـ ٢ـ بررسی خصوصیات مرفولوژیکی میکروسکوپی استرپتومایسس پیلوسوس………………………… ۱۱۶

۶ ـ٣ـ رسم منحنی رشد استرپتوماسیس پیلوسوس در محیط کشت MYB……………………………….. 116

6-4- رسم منحنی pH بر حسب زمان در محیط کشت Soybean حاوی سویه استرپتومایسس پیلوسس…. ۱۱۸

۶ ـ ۵ـ تشخیص کیفی و کمی دسفری اکسامین تولیدی………………………………………………………… ۱۲۰

۶-۵-۱- تشخیص کیفی و تولید و یا عدم تولید دسفری اکسامین……………………………………………. ۱۲۰

۶ـ۵ـ۲ـ رسم نمودار استاندارد دسفرال……………………………………………………………………………… ۱۲۰

۶ـ۵ـ۳ـ میزان دسفری اکسامین تولیدی در هر روز توسط سویه استرپتومایسس پیلوسوس در محیط Soy bean……………………………………………………………………………………………………………………………… 121

6-6- نتایج مربوط به استخراج دسفری اکسامین تولید شده توسط سویه استرپتومایسس پیلوسوس…… ۱۲۲

۶-۶-۱- نتایج مربوط به تأیید وجود دسفری اکسامین B در ماده استخراج شده………………………….. ۱۲۲

۶-۷-  بهینه سازی محیط کشت تولید دسفری اکسامین………………………………………………………… ۱۲۴

۶-۷-۱  بررسی اثر اسید آمینه ترئونین بر تولید دسفری اکسامین……………………………………………… ۱۲۴

۶-۷-۱-۱- بررسی اثر اسید آمینه ترئونین بر تولید دسفری اکسامین در یک محدوده غلظت…………… ۱۲۴

۶ـ۷ـ ٢ـ بررسی اثر اسید آمینه های ترئونین و لوسین و ویتامین تیامین (B₁ )…………………………….. 126

6 ـ ۷ـ٣ـ بررسی گلوکز ، ملاس، سوکروز بر تولید دسفری اکسامین………………………………………… ۱۲۶

۶ـ ۷ـ ۴ـ بررسی اثر شلاته کننده های کاتیون بر میزان تولید دسفری اکسامین…………………………….. ۱۲۷

۶ـ ۷ـ ۵ـ استفاده از محیط کشت عصاره مخمر به جای استفاده از محیط کشت Soybean………….. 128

6 ـ ۷ـ ۶ـ بررسی اثر مواد معدنی مختلف بر میزان تولید دسفری اکسامین…………………………………. ۱۲۸

۶ – ۷ – ۶ – ۱ – بررسی اثر مواد مختلف با غلظت متفاوت بر میزان تولید دسفری اکسامین ……….. ۱۳۰